根据症状、病变可诊断。可疑病畜用棉拭子取直肠擦物，死畜用回肠粘膜涂片，抗酸染色检查确定。有条件时做细菌分离培养。畜群检疫可用变态反应和血清补体结合反应。病羊腹泻反复发生，稀便呈卵黄色、黑褐色，带有腥臭味或恶臭味，并带有气泡。开始为间歇性腹泻，逐渐变为经常性而又顽固的腹泻，后期呈喷射状排出。有的母羊泌乳少，颜面及下颌部水肿，腹泻不止，最后消瘦骨立，衰竭而死。病程长短不一，病程4-5天，长的可达70多天，一般是15-20天。
刮取病变肠段黏膜制成涂片，火焰固定，在触片上滴满石炭酸复红液。涂片下用火焰加热直到有蒸汽出现，注意最好不要产生气泡，大约需要5~6分钟。水洗，然后通过酸性酒精溶液脱色，大约需0.5~1分钟，直至无色为止。最后用亚甲兰溶液复染约1分钟，水洗，吸干，经抗酸染色后镜检，能够观察到成丛成团、细长稍弯的红色副结核杆菌。
鉴别诊断：①沙门氏菌病的鉴别。该病多呈急性或亚急性经过，以病羊出现黄疸、血尿和皮肤及黏膜出血、坏死为主要特征，从病羊粪便中可以分离到致病性沙门氏菌。②营养不良的鉴别。羊只出现营养不良常发生于冬春枯草时节，病羊虽然也会出现消瘦和腹泻症状，然而病羊的肠道却没有羊副结核病(肠黏膜显著增厚且形成皱褶)的病理变化。③胃肠道寄生虫病的鉴别。该类寄生虫病通常能够在粪便中看到大量的虫卵，对病死羊剖检可见胃肠道有寄生虫，而且无羊副结核病的肠黏膜增厚并形成褶皱的变化。
